Jumat, 03 Desember 2010

UJI SIFAT BIOKIMIA


I.             PENDAHULUAN
A.    Latar Belakang
Aktivitas kimiawi sel yang dilakukan oleh bakteri sangatlah rumit. Pada dasarnya aktivitas kimiawi sel bakteri seperti metabolisme dilakukan dengan bantuan katalisator. Dalam hal ini, katalisator yang digunakan adalah biokatalisator yaitu enzim. Enzim ini akan membantu bakteri dlam hal seperti kegiatan fisiologis meliputi penyusunan zat organik, pencernaan makanan, pembongkaran dan zat makanan. Adanya tipe enzim tertentu dalam baketri akan membuat bakteri tersebut spesifik terhadap substrat tertentu, sehingga dapat pula dilakukan untuk menguji sifat bakteri(Waluyo,2007). Misal, pada Bacillus subtilis memiliki enzim amylase yang digunakan untuk menghidrolisis pati(Clifton, 1958).
Selain aktivitas tersebut pada bakteri juga dilakukan aktivitas yang disebut respirasi aerob. Dalam respirasi ini molekul kompleks seperti lipid, protein, dan karbohidrat akan dirombak menjadi senyawa turunannya seperti asam lemak, asam amino, dan monosakarida. Setelah itu turunan dari senyawa komplek tersebut akan didegradasi menjadi senyawa yang disebut piruvat. Dalam proses ini akan melepaskan energy yang dibutuhkan oleh bakteri. Proses ini hanya dapat terjadi dalam kondisi beroksigen, karena itu disebut respirasi aerob. Dan bakteri yang memiliki kemampuan untuk melakukan proses respirasi dan hidup dilingkungan beroksigen disebut bakteri aerob(Prescott et.al.,2008).
Bakteri dalam kondisi lingkungan minim oksigen maupun tanpa oksigen dapat melakukan aktifitas seperti fermentasi untuk mendapatkan energinya. Fermentasi adalah proses memproduksi energi dengan menggunakan bahan organic sebagai donor dan aseptor electron. Bakteri fakultatif anaerob dan  obligat anaerob dapat melakukan berbagai tipe fermentasi, seperti fermentasi asam laktat, fermentasi alcohol, dan sebagainya(Pelczar et.al, 1997).
Selain itu ada juga bakteri yang menggunakan nitrat sebagai electron, yang disebut sebagai Nitrifying bacteria. Energi akan terbentuk pada saat proses oksidasi nitrat. Dalam hal ini bakteri nitrogen akan menggunakan aseptor lalu melepaskan nitrogen ke atmosfer(Salle, 1961).
B.     Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mempelajari sifat-sifat biokimia bakteri Bacillus subtilis dan Escherichia coli.
II.          METODE
A.    Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang dibutuhkan dalam pecobaan ini meliputi: Biakan murni B. Subtilis dan E.coli dalam medium nutiren cair umur 24 jam; media glukosa cair, laktosa cair, dan sukrosa cair dengan indikator fenol merah, glukosa padat, laktosa padat, dan sukrosa padat dengan indikator Bromothymol blue (BTB); jarum ose dan jarum inokuasi untuk menginokulasikan bakteri; media pati agar; cawan petri steril; larutan Iod; media hidrolisat kasein atau media byang mengandung triptofan; reagen kimia Erlich dan eter untuk medeteksi indol; pipet steril untuk mengambil reagen; medium nitrat cair; larutan asam sulfinat dan alpha nephathylamine; medium BCPM untuk uji fermentasi dan peptonisasi.
B.     Cara Kerja
Hasil biakan murni B. Subtilis dan E.coli  yang telah diinkubasikan selama 24 jam diinokulasikan ke dalam masing-masing media uji. Pada medium padat inokulasi dilakukan secara tusukan menggunakan jaum inokulasi pada tabung reaksi. Pada media cair (karbohidrat, hidrolisat kasein, BCPM dan nitrat cair) inokulasi dilakukan dengan ose pada tabung reaksi. Pada medium agar inokulasi dilakukan secara streak dengan ose pada cawan Petri. Hasil inokulasi diinkubasi pada suhu kamar selama minimal 24 jam.
Setelah 24 jam, untuk uji karbohidrat, diamati perubahan yang terjadi dalam tabung reaksi dan tabung durham. Untuk hidrolisis pati ditetesi larutan iod, kemudian diamati zona jernih yang terbenuk di sekitar koloni. Untuk pembentukan indol, tambahkan reagen eter kemudian gojog. Selanjutnya tambahkan reagen Erlich melalui dinding tabung. Selanjutnya diamati terbentuknya cincin merah diantara lapisan mdium dan eter. Untuk uji reduksi nitrat, pada tabung reaski ditambahkan 1 ml asam sulfanilat da 1 ml laruan alpha naftilamin, digojog sampai merata, kemudian amati terbentuknya warna merah sebagai tanda terjadinya reduksi nitrat menjadi nitrit. Untuk uji fermentasi dan peptonisasi amati terjadinya endapan sebaai indikasi terjadinya fermentasi dan perubahan warna menjadi gradasi sebagai tanda terjadinya peptonisasi.

III.       HASIL DAN PEMBAHASAN
A.    Hasil
Setelah dilakukan percobaan dan pengamatan didapatkan hasil sebagai berikut,
Tabel 1. Hasil Uji Sifat Biokimia Terhadap E.Coli dan Bacillus subtilis
No.
Media
Perlakuan/Ino-kulasi
Indicator/Rea-gen dan Warna Awal
Reaksi
Perubahan warna
Keterangan
1
Glukosa padat
Kontrol
Phenol Red
(merah)

Merah

B. subtilis
Negatif
Merah

E.coli
Positif
Fermen-tasi
Kuning

2
Glukosa cair
Kontrol
Phenol Red
(merah)

Merah

B. subtilis
Negatif
Merah

E.coli
Positif
Fermen-tasi
Kuning

3
Sukrosa padat
Kontrol
Phenol Red
(merah)

Merah

B. subtilis
Negatif
Merah

E.coli
Positif
Fermen-tasi
Kuning
Terdapat gelembung
4
Sukrosa cair
Kontrol
Phenol Red
(merah)

Merah

B. subtilis
Positif
Fermen-tasi
Kuning 

E.coli
Positif
Fermen-tasi
Kuning

5
Laktosa padat
Kontrol
Phenol Red
(merah)

Merah

B. subtilis
Negatif
Merah

E.coli
Positif
Fermen-tasi
Kuning

6
Laktosa cair
Kontrol
Phenol Red
(merah)

Merah

B. subtilis
Negatif
Merah

E.coli
Positif
Fermen-tasi
Kuning
Terdapat gelembung
7
BCPM
Kontrol
BCP
(purple)

Abu-abu

B. subtilis
Peptonisasi
Biru

E.coli
Fermentasi
Kuning

8
Hidrolisat kasein
Kontrol
Eter
Reagen Erlich
Dua Lapisan Jernih

Bening

B. subtilis
Negatif
Bening
Hanya ada lapisan jernih tetapi tidak ada warna ungu.
E.coli
Negatif
Bening
Hanya ada lapisan jernih tetapi tidak ada warna ungu.
9
Nitrat
Kontrol
Asam Sulfanilat
a-naftilamin
(jernih)

Kuning

B. subtilis
Positif
Merah bata

E.coli
Positif
Merah bata

10
Pati
Kontrol
JKJ
(biru)



B. subtilis
Negatif
Tidak ada zona jernih

E.coli
Negatif
Tidak ada zona jernih


B.     Pembahasan
Pada bakteri Bacillus subtilis dan Escherichia coli dilakukan uji biokimia seperti uji fermentasi. Uji fermentasi dilakukan dengan medium glukosa padat dan cair, sukrosa padat dan cair, laktosa padat dan cair. Fermentasi adalah penggunaan piruvat atau derivatnya sebagai aseptor electron untuk mengoksidasi NADH menjadi NAD+(Presscott et.al, 2008). Sedangkan fermentasi karbohidrat adalah perombakan monosakarida menjadi alkohol, gas karbondioksida, asam organik dan energi dengan bantuan mikrobia. Adanya asam organik akan mengubah pH medium sehingga indikator akan memberikan respon dan terjadi perubahan warna pada medium. Pada indicator fenol merah yang digunakan jika dalam kondisi asam akan menjadi berwarna kuning.
Hasil yang ditunjukan dalam uji fermentasi menggunakan medium yang berisi gula berupa glukosa padat dan cair, sukrosa padat dan cair, laktosa padat dan cair pada E.coli semuanya adalah positif. E.coli memiliki enzim beta-galaktosidase yang dapat memecahkan laktosa menjadi glukosa dan galaktosa. Selain itu E.coli juga memiliki enzim sukrase yang dapat memecah sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa. Setelah semua gula menjadi sederhana yaitu berupa monosakarida, proses fermntasi dapat terjadi pada medium-medium tersebut. Hasil fermentasi akan mengeluarkan asam organik yang dapat merubah pH medium, karena itu medium tersebut akan mengalami perubahan warna akibat respon indikator didalamnya.
Selain factor tersebut, E.coli merupakan bakteri anaerob fakultatif yang dapat hidup dalam tidak hanya dalam kondisi aerob, sehingga kemampuan dalam memfermentasikan zat sangat diperlukan untuk kelangsungan hidupnya karena E.coli mendapatkan energi dari proses fermentasi tersebut.
Pada B.subtilis reaksi positif yang menunjukan adanya proses fermentasi hanya terjadi pada medium sukrosa padat. Hal ini terjadi karena B.subtilis memiliki enzim sukrase yang dapat memecah sukrosa menjadi fruktosa dan glukosa yang merupakan monosakarida yang dapat difermentasikan. Selain itu karena B.subtilis merupakan bakteri aerob, pada medium padat minimnya kadar oksigen akan memicu dilakukannya fermentasi terhadap zat tersebut untuk mendapatkan energy. Sedangkan pada medium sukrosa cair, B.subtilis yang merupakan bakteri aerob akan berusaha menuju permukaan dan melakukan respirasi aerob, sehingga tidak perlu melakukan fermentasi. Pada medium lainnya seperti glukosa cair dan padat, laktosa cair dan padat menunjukan hasil fermentasi negatif.  Pada medium dengan gula laktosa, B.subtilis tidak memiliki enzim beta-galaktidase, sehingga laktosa akan tetap berbentuk disakarida, sehingga tidak dapat difermentasikan.
Uji selanjutnya adalah mengenai kemampuan B.subtilis dan E.coli dalam melakukan fermentasi atau peptonisasi terhadap susu dengan menggunakan medium BCPM (Brom Cresol Purple Milk). Pada medium BCPM yang diinokulasikan E.coli menunjukan hasil yaitu perubahan warna yang pada awalnya berwarna keabu-abuan menjadi berwarna berwarna kuning. Warna kuning yang terjadi disebabkan oleh adanya respon indicator terhadap perubahan pH yang menjadi asam. Asam yang terdapat didalam medium adalah asam organik hasil fermentasi oleh E.coli. Fermentasi yang terjadi didalam medium tersebut  adalah fermentasi laktosa. E.coli merupakan bakteri yang memiliki enzim beta-galaktosidase yang dapat memecah laktosa menjadi glukosa dan galaktosa, sehingga E.coli mampu memfermentasikan laktosa.  E.coli tidak bisa melakukan peptonisasi karena asam organic yang dihasilkan dalam proses fermentasi akan menggumpalkan kasein, sehingga kasein tidak bisa dirombak. Akhirnya proses peptonisasi tidak dapat dilakukan.
Pada medium BCPM yang diinokulasikan B.subtilis menunjukan perubahan warna yang semula keabu-abuan menjadi berwarna biru. Berubahnya warna pada medium ini disebabkan oleh hasil peptonisasi yang menyebabkan pH medium yang semula netral menjadi cenderung ke basa, sehingga indikator didalamnya akan merespon dengan berubah warna. Peptonisasi dapat terjadi karena B.subtilis tidak memiliki enzim beta-galaktosidase sehingga tidak dapat memecah laktosa sehingga fermentasi tidak terjadi lalu asam organic tidak terbentuk dan kasein tidak menggumpal. Karena kasein tidak menggumpal maka kasein akan dihidrolisis oleh enzim rennin dan enzim protease yang terdapat dalam B.subtilis menjadi para kasein dan pepton-pepton terlarut.
Uji selanjutnya adalah uji pembentukan indol dengan menggunakan medium hidrolisat kasein yang didalamnya terkandung asam amino Triptofan. Triptofan yang memiliki cincin indol akan didegradasi oleh bakteri dengan bantuan eter. Setelah itu, indol yang dilepaskan akan berikatan dengan reagen Ehrlich membentuk cincin warna merah. Tetapi hasil uji terhadap E. coli menunjukan reaksi negatif. Hal ini bisa saja disebabkan karena E.coli  tidak dapat mendegradasi triptofan yang tersedia sehingga pembentukan indol tidak dapat terjadi. Hasil yang sama terjadi B.subtilis yaitu menunjukan reaksi negatif.
Uji selanjutnya adalah uji kemampuan E.coli dan B.subtilis dalam mereduksi nitrat menggunakan medium nitrat. E.coli dan B.subtilis menunjukan hasil positif, mampu mereduksi nitrat menjadi nitrit ditandai dengan terbentuknya perubahan warna dari kuning menjadi warna merah. E.coli merupakan bakteri fakultatif anaerob merupakan bakteri yang dapat hidup dilingkungan dengan atau tanpa oksigen. Pada kondisi aerob E.coli dapat menggunakan oksigen untuk mendapatkan energi, sedangkan dalam kondisi anaerob nitrat dapat digunakan oleh E.coli sebagai aseptor organik dalam usaha memperoleh energi. Sehingga E.coli memiliki kemampuan untuk mereduksi nitrat. Sedangkan untuk B.subtilis dapat mereduksi nitrat karena kemungkinan kondisi dalam medium tersebut anaerob sehingga memicu B.subtilis melakukan reduksi nitrat untuk memperoleh energi sebagai proses untuk mempertahankan hidupnya.
Uji biokimia yang terakhir dilakukan dalam praktikum kali ini adalah uji kemampuan bakteri dalam  menghidrolisis pati. Hasil yang didapatkan setelah penetesan Iod adalah pada E. coli dan B. subtilis tidak terdapat zona jernih yang berarti reaksi negatif. Tetapi setelah ditunggu beberapa lama hasil menunjukan bahwa pada B. subtilis & E. coli timbul zona jernih. Hal ini berarti reaksi yang terjadi sangat lambat, selain itu pada percobaan kali ini larutan Iod yang digunakan warnanya sangat bening dan encer, kemungkinan konsentarsinya rendah. Karena kedua mikrobia tersebut dapat menghasilkan dapat menghidrolisis pati, maka berarti kedua bakteri tersebut memiliki enzim amilase.
IV.       KESIMPULAN
Dari hasil uji diatas dapat disimpulkan bahwa B. subtilis memiliki sifat biokimia seperti memiliki enzim sukrase, memiliki enzim rennin dan protease, tidak dapat membentuk indol, dapat mereduksi nitrat, dan memiliki enzim amilase untuk menghidolisis pati. Sedangkan bakteri E. coli memiliki sifat biokimia seperti, memiliki enzim beta-galaktidase, enzim sukrase,tidak dapat membentuk indol, dapat mereduksi nitrat, dan memiliki enzim amilase.
V.          DAFTAR PUSTAKA

Cliffton, C.E., 1950. Introduction to the bacteria. McGraw-Hill Book Company, Inc. P.162
Pelczar, M.J.Jr, E. C. S Chan, and N. R. Krieg.1997. Microbiology. McGraw-Hill Book Company Inc. New York,  p:183-184.
Prescott, L. M, J. P. Harley, dan D. A. Klein. 2008. Microbiology. 7th Ed. McGraw-Hill Book Company Inc. USA, p: 116
Salle, A. J. 1961. Fundamental Principles of Bacteriology. 5 th ed McGraw-Hill Book Company. New York, pp 203-218.
Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum. Malang. Penerbitan Universitas Muhammadiyah Malang , hal 157.

Tidak ada komentar:

Poskan Komentar